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.前言
白蟻是一種世界性重要害蟲。全世界已知白蟻種類有約3000種[1]，我國約400多種[2]，在長江以南地區危害尤為嚴重。它們與人類經濟密切相關，可對人類社會造成較大危害[3-4]。早期傳統的形態分類法為白蟻的分類鑒定奠定了基礎。白蟻的外部形態相似，目前白蟻主要依靠兵蟻或有翅成蟲進行分類[5]。但是在區分一些相似種、近緣種上難度較大，容易引起誤判[6-7]。同時，白蟻的形態學分類往往需要一定數量的個體，分類時個體太少則會影響結果的可靠性，而有些白蟻種群的兵蟻很少，這都給白蟻的分類帶來了較大的困難。
基于聚合酶鏈式反應( Polymerase chainreaction, PCR)技術為物種鑒定提供了新的手段，彌補了傳統形態鑒定的諸多不足[8]。該技術通過引物和模板DNA特異性的結合, 可在短時間內擴增出數百萬特異DNA序列拷貝。它具有如下幾個優點：（1）不受白蟻組織類別、發育階段等影響。DNA上得到的信息不會隨白蟻發育時期的不同而變化。（2）不受環境影響。因為環境只影響基因表達，而不改變基因的核苷酸序列。（3）DNA分子標記技術簡單、快速、易于自動化。（4）提取的DNA樣品，在低溫下可長期保存[9]。因此，近年來分子生物學技術被越來越廣泛地應用于白蟻分類研究中。線粒體編碼細胞色素c氧化酶亞基Ⅱ基因（COⅡ）已成為當前動物分子系統中應用最廣泛的分子標記[10]。Jenkins等首次利用COⅡ基因序列推斷臺灣乳白蟻入侵危害的途徑[11]。Miura等利用線粒體COⅡ基因和翻譯的蛋白質序列對進化較高的白蟻科和鼻白蟻科15個屬的系統發育關系進行了研究[12]。
本研究在廣東省范圍內采集白蟻標本，并采用基于COⅡ基因部分序列的PCR產物直接測序法鑒別確認白蟻種類，該研究可為今后開展白蟻種群分布和危害調查提供科學基礎，從而進一步掌握蟻害發生特點，提高白蟻防治水平。
2.材料和方法
2.1材料和儀器
2.1.1材料和試劑
一次性組織研磨棒、1.5mL離心管、200μL PCR薄壁管，1000μL、200μL、10μL槍頭、上下游引物均購；Takara r-taq 酶（250U）、Takara DL 2000 DNA marker（500μL）購；EasyPure Genomic DNA提取試劑盒、Axygen膠回收試劑盒、Biowest Agarose瓊脂糖（100g）。
2.1.2儀器設備
梯度PCR儀、瓊脂糖水平電泳儀、手提紫外分析儀、Fresco 21微型離心機、凝膠成像系統、電子分析天平（0.0001g）、全自動蒸汽高壓滅菌鍋、移液槍、超級恒溫水浴鍋。
2.2試驗方法
2.2.1白蟻樣本采集
從全廣東省范圍內，特別是白蟻危害重點區域采集白蟻標本。采集白蟻時，取活體或死亡時間少于24 h的完整成蟲體，密封保存于99.9%酒精的樣本瓶中，做好標簽和記錄。
2.2.2白蟻組織基因組DNA提取
選取白蟻整體為試驗材料，用紙巾將樣品表面的酒精和水分吸干后，稱重，控制樣品質量≤25 mg。樣品用研磨棒研磨，采用EasyPure Genomic DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA。最后用EB溶液進行兩次洗脫，合并兩次的洗脫液用于PCR反應的模板。
2.2.3 PCR擴增COⅡ基因部分序列
2.2.3.1引物
通常用于種群分類分析的基因是16S rRNA、COI、COII、ND1、ND5[2]。本文采用以下引物用于片段擴增：上游引物COⅡ1：5’-CAGATAAGTGCATTGGATTT-3’；下游引物COⅡ2：5’-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’。
2.2.3.2擴增體系
采用Takara公司生產的PCR試劑盒。反應體系50μL，包括：5μL10×buffer(Mg2+-)，4μLdNTP，3μLMg2+,正反引物各1μL(20 mmol/L)，1μLDNA模板，17μL滅菌超純水。
PCR反應條件如下：起始94℃預變性3min，然后94℃變性30s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環。最后72℃反應10 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用EB染色。用DNA marker（DL2000）標記擴增片段大小，以確定是否為目的片段。電泳后置于凝膠成像系統觀察。
對于有雜質，需要純化的PCR產物，采用Axygen膠回收試劑盒純化后測序；對于擴增效果良好的PCR產物則可直接測序。本實驗廣東生物資源應用研究所進行測序和拼接，每個樣品采用正反鏈雙向測序，以提高測序的準確度。
2.2.4數據分析
根據委托公司發回的測序結果，將正反鏈拼接得出的堿基序列在NCBI網站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行BLAST相似性搜索，選擇相似度最高的確定為該物種。
3.結果與分析
3.1白蟻標本采集結果
在廣東省范圍內，特別是白蟻危害重點區域共收集有效白蟻標本185個。
3.2 PCR擴增結果
以編號zj144、zj035、zj115、zj102、zj101、zj100、zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、zj092的樣品為例，PCR擴增結果見圖1。引物對檢測樣本擴增出800bp左右的條帶。結果顯示，檢測樣本的PCR擴增結果與設計目標相同；同時，目標條帶明亮清晰，說明PCR擴增特異性較高，效果良好，PCR產物可直接測序。
圖1引物PCR擴增圖（從左到右條帶分別為DNA marker（DL2000）、zj144、zj035、zj115、 zj102、zj101、 zj100、 zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、 zj092）
3.3 測序結果
以編號zj004的白蟻標本為例，測序后拼接得出的堿基序列如圖2所示。將堿基序列在NCBI網站上進行BLAST相似性搜索，結果見圖3。結果顯示，zj004號樣本與臺灣乳白蟻這一物種的基因相似度最高，相似度達99%。同時結合形態學特征，確認zj004號樣本為臺灣乳白蟻。
圖2 zj004號白蟻樣本拼接堿基序列
4.總結與展望
本研究在廣東省范圍內采集白蟻標本185份，經分子生物學方法共鑒定出2科4屬7種白蟻。散白蟻所占比例明顯高于其他屬白蟻，其中黑胸散白蟻比例最高，為該地區優勢蟻種。
隨著分子生物學的發展，利用分子生物學技術進行種類鑒別、檢測的應用越來越多[13-14]。本文利用分子生物學技術對白蟻種類做出鑒別，無論白蟻何種生物型和蟲態，均可用于鑒定；同時需要的樣品量少，簡便快捷，提取的DNA模板可用于多次檢測。但需要注意的是，要防止昆蟲標本DNA降解，才能獲得可靠準確的遺傳信息。相信隨著研究的不斷深入，實驗技術將不斷完善和提高。在結合形態學鑒定的基礎上，現代分子生物技術正成為白蟻分類鑒定的有力手段，為進一步開展白蟻的分布和危害調查提供更為堅實的科學基礎，并為白蟻防治提供新的方法和思路。
廣東房安白蟻防治
2017年3月18日
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